Białko

Oddzielne zagadnienie w analizie aminokwasów stanowi ozna­czanie tryptofanu, który podczas hydrolizy kwasowej 6N HC1 ulega prawie całkowitemu rozkładowi. Istnieje szereg metod do oznaczania tego ważnego aminokwasu.

Tryptofan w białkach spożywczych często jest oznaczany w reakcji barwnej z ninhydryną po hydrolizie alkalicznej bada­nego materiału za pomocą wodorotlenku sodowego lub wodoro­tlenku barowego.

Slump i Schreuder (1969) zastosowali hydrolizę za pomocą wodorotlenku barowego, a następnie oddzielenie uwolnionego tryptofanu od jonów baru za pomocą filtracji na żelu Sephadex. Następnie tryptofan oznaczano na automatycznym analizatorze w reakcji barwnej z ninhydryną. Sławiński i Tyczkowska (1974), badając optymalne warunki hydrolizy za pomocą wodorotlenku barowego, stwierdzili że maksimum uwolnienia tryptofanu w hydrolizatach uzyskiwano za pomocą 2,15N Ba(OH)₂ w tempe­raturze 110°C, w czasie 4—16 godzin dla surowców zwierzęcych i 12—16 godzin dla surowców roślinnych. Autorzy ci stwierdzili ponadto, że za pomocą metody kolorymetrycznej z aldehydem p-dwumetyloaminobenzoesowym uzyskali wyniki podobne, jak przy zastosowaniu automatycznego analizatora aminokwasów.

Jak podano w punkcie 5.1.1. są także przeprowadzane próby zapobiegające destrukcji tryptofanu w czasie hydrolizy kwasowej, poprzedzającej analizę za pomocą chromatografii jo­nowymiennej (Matsubara i Sasaki 1969, Penke i wsp. 1974, Liu i Chang 1971). Penke i wsp. (1974) stwierdzają jednak, że zapo­bieganie destrukcji tryptofanu przy dużej zawartości cukrow­ców w próbce nie jest zadowalające.

Opracowano również metody z zastosowaniem hydrolizy enzymatycznej badanego materiału, a następnie oznaczeniem tryptofanu w reakcjach barwnych specyficznych dla pierścienia indolowego, z takimi odczynnikami jak: aldehyd p-dwumetylo-aminobenzoesowy (p-DAB), aldehyd dwumetyloaminocynamono-wy, kwas glioksalowy, kwas p-toluenosulfonowy oraz imid N-bromobursztynowy.

Wśród tych metod na uwagę zasługuje metoda Horna i Jonesa (1945), w modyfikacji Lombarda i de Langa (1965), a w polskim piśmiennictwie metoda opisana przez Skibińską i wsp. (1970). Tryptofan w metodzie tej jest oznaczany po wstępnej hydrolizie enzymatycznej badanego białka za pomocą papainy, w reakcji barwnej z aldehydem p-dwumetyloaminobenzoesowym (p-DAB). Natężenie niebieskiego zabarwienia jest odczytywane na kolorymetrze przy długości fali 600 nm. Powtarzalność wy­ników jest zadowalająca, współczynnik zmienności waha się za­leżnie od materiału badanego od 2,1 do 5,1%. Metoda jest jed­nak dość czasochłonna (hydroliza enzymatyczna trwa 18 godzin). Istnieją różne modyfikacje tej metody. Sławiński i wsp. (1974) jako wstępną zastosowali hydrolizę alkaliczną zamiast hydrolizy enzymatycznej. Spies i Chambers (1950), którzy jako pierwsi za­stosowali reakcję aldehydu p-dwumetyloaminobenzoesowego z wolnym tryptofanem, zaproponowali w 1967 r. wstępne trawie­nie badanego białka za pomocą pronazy.

Spośród metod, które nie wymagają hydrolizy, należy wymienić metodę glioksalową. Opiera się ona na reakcji pierście­nia indolowego z kwasem octowym w obecności chlorku żelaza­wego. Reakcja zaobserwowana przez Adamkiewicza została opi­sana przez Hopkinsa i Cole w 1902 r. (cyt. wg Concona 1975). Opracowano kilka modyfikacji tej metody m.in. Opieńska–Blauth i wsp. (1963), Concon J. M. (1975). Według porównań do­konywanych przez Concona metoda ta daje wiarogodne wyniki.

Comments are closed.