Białko

W przypadku badania produktów spożywczych lub pasz rzadko mamy do czynienia z białkami czystymi. Hydrolizę białka prze­prowadza się zatem w środowisku złożonym, w którym obecne są czynniki, a zwłaszcza cukrowce, mogą wpływać niekorzystnie na przebieg procesu hydrolizy.

Tłuszcz nie odgrywa większej roli, bo może być łatwo usunięty z próbki drogą ekstrakcji. Stosowana powszechnie hydroliza kwasowa białka za pomocą 6N HC1 w temperaturze 105°C powoduje destrukcję niektórych aminokwasów oraz może prowadzić do absorbowania części aminokwasów na tworzących się z cukrowców substancjach huminowych (Pion 1971). W przy­padku tryptofanu, który w tych warunkach ulega rozłożeniu, jest konieczne przeprowadzenie oddzielnej hydrolizy zasadowej lub enzymatycznej (Friedman i Finley 1975).

Innym zagadnieniem jest oznaczanie aminokwasów siar­kowych, które w czasie hydrolizy mogą ulec częściowemu rozło­żeniu lub utlenieniu. Uwzględniając to, przeprowadza się przed hydrolizą całkowite utlenienie tych aminokwasów, tj. metioniny do sulfonu metioniny, a cystyny do kwasu cysteinowego i w tej formie oznacza się ich zawartość w białku. Utlenione formy ami­nokwasów są stabilne w przebiegu dalszej kwaśnej hydrolizy (Moore 1963, Pion i wsp. 1966). Pozostałe aminokwasy, poza omówionymi, są uwalniane w trakcie hydrolizy kwaśnej z róż­ną szybkością. Na przykład seryna i treonina są uwalniane cał­kowicie stosunkowo szybko (20-24 godziny), podczas przedłużo­nej hydrolizy, następuje częściowe ich rozłożenie. Podobnie za­chowuje się tyrozyna. Natomiast izoleucyna i walina wymagają dłuższego czasu hydrolizy (72 godziny). Wobec różnej szybkości uwalniania poszczególnych aminokwasów prowadzi się albo hy­drolizę w kilku wariantach pod względem czasu i zastosowanie środków ochronnych (Pion 1971), albo też prowadzi się hydro­lizę białka w określonym czasie, np. 20-24 godziny przy jedno­czesnym zastosowaniu obliczonych doświadczalnie współczynni­ków korekcji dla aminokwasów uwalnianych w różnym czasie (Sławiński i wsp. 1973).

Badane produkty poddawane hydrolizie powinny zawie­rać nie więcej niż 5% wody oraz najwyżej śladowe ilości tłusz­czu. Jeśli próbki zawierają większe ilości wody oraz tłuszcz, na­leży je poddać ekstrakcji acetonem w celu odtłuszczenia i od­wodnienia (Brieskom 1963). W tablicy 25 podano stosowany przez autorki schemat warunków hydrolizy za pomocą 6N HC1 prowadzonej w temperaturze 105°C. Stosunek próbki do ilości kwasu solnego powinien być nie niższy niż 1 : 400 (wagowo).

Przeprowadza się cztery równoległe procesy hydrolizy badanej próbki. Dwa razy powtarza się hydrolizę kwaśną 20-godzinną w celu uzyskania podwójnych wyników dla aminokwa­sów aromatycznych i histydyny. Ważne jest, aby hydroliza przebiegała w warunkach beztlenowych, dlatego próbki umiesz­cza się w ampułkach zatopionych pod próżnią. Dodatkowo, w celu zabezpieczenia przed utlenieniem tyrozyny i fenyloalaniny, dodaje się do próbki kilka kropli 5-procentowego roztwo­ru fenolu. Końcowe stężenie fenolu w hydrolizacie jest wielo­krotnie wyższe (ok. 50 razy) w porównaniu do stężenia amino­kwasów aromatycznych, a zatem w przypadku obecności sub­stancji utleniających, jest utleniany głównie fenol, chroniąc w ten sposób tyrozynę i fenyloalaninę.

Równocześnie prowadzi się hydrolizę poprzedzoną utle­nieniem białka w dwóch wariantach czasowych przez 20 : godzin (tabl. 25). Białko utlenia się za pomocą kwasu mrówko­wego (HCOOH+H₂0₂ 30-procentowego w stosunku 9 : 1) doda­wanego w ilości 10 ml do próbki (czas utleniania 20 godzin, temperatura 4°C). Po utlenieniu, metioninę i cystynę oznacza się w postaci jej trwałych pochodnych. Mieszanina aminokwa­sów po przeprowadzonej hydrolizie jest odparowywana do sucha, a następnie rozpuszczana w 0.01N HC1 o pH = 2,0. W tym stanie jest przechowywana i nakładana na kolumnę chromatograficzną w ilości 0,8 ml o stężeniu aminokwasów ok. 0,1 mikromola/ml.

Metody oznaczania tryptofanu omówiono oddzielnie przy końcu tego rozdziału.

Omówione warunki standardowe hydrolizy białek są przyjmowane w licznych laboratoriach. Wiadomo jednak, że hydroliza kwasem solnym budzi szereg zastrzeżeń i są prowadzone liczne próby nad jej udoskonaleniem.

Matsubara i Sasaki (1969) prowadzili hydrolizę białek za pomocą 6N HC1 z dodatkiem 0,6′% kwasu tioglikolowego, w celu wyeliminowania rozkładu tryptofanu zachodzącego w czasie hydrolizy kwaśnej. W tym samym celu Liu i Chang (1971) zastosowali 3N kwas p-tolueno-sulfonowy zawierający 0,2% 3-(2-aminoetyl), indolu.

Penke,- Ferenczi, Kovacs (1974) zaproponowali zastosowa­nie 3N kwasu merkaptoetanosulfonowego w temperaturze 110°C przez 24 i 72 godziny, w celu uzyskania pełnego spektrum aminokwasowego łącznie z tryptofanem. Dotychczasowe próby w tym zakresie były przeprowadzane na czystych białkach, aczkolwiek rozważano również wpływ dodatku cukrowców.

Aktualnie są prowadzone próby wskazujące na duże na­dzieje zastosowania 3N kwasu merkaptoetanosulfonowego do hy­drolizy białka różnego typu produktów żywnościowych (Bod-well C. E. 1975)D.