Niezbędna jest dokładna analiza składu biomasy bakterii i drożdży, ze szczególnym uwzględnieniem analizy zawartości pierwiastków mineralnych, składu kwasów tłuszczowych, gdy ilość tłuszczu przekracza , zawartości kwasów nukleinowych oraz błonnika. Przed zastosowaniem krótkotrwałych badań bio­logicznych nad strawnością i jakością białka, są niezbędne bada­nia żywieniowe na kilku gatunkach zwierząt doświadczalnych, jak myszki, szczury, króliki, przy zawartości białka, pochodzą­cego z niekonwencjonalnych źródeł, odpowiadającej wysokości optymalnej dla wzrostu tych zwierząt. Obserwacjom poddaje się przebieg krzywych wzrostu i zachowania się zwierząt w okresie 3 miesięcy. Badania te określają bezpieczeństwo zastosowania no­wych źródeł białka do celów żywieniowych. W niektórych przy­padkach niezbędne są badania toksyczności przewlekłej.

1)    syntezy chemicznej lub mikrobiologicznej aminokwa­sów (lizyna, metionina, tryptofan, kwas glutaminowy);

2)    izolacji — oczyszczonego, lub koncentracji przez częś­ciowe oczyszczenie — białka ze źródeł dotąd nie wykorzystywa­nych do bezpośredniego żywienia człowieka, jak: serwatka mleka, poekstrakcyjne śruty nasion oleistych, białka rybnego z drobnych ryb łub kryla, lub nawet masy zielonej roślin bogatych w wysokowartościowe białka np. lucerny i niektórych traw;

3)    produkcja białka przez kultury jednokomórkowców (bakterii) lub plechowców (drożdże, glony), na podłożach odpa­dowych: melasie, ługach posulfitowych, serwatce lub ściekach mleczarskich, hydrolizowanych odpadach rolniczych, jak słoma lub łęty ziemniaczane, a także na płynnych węglowodorach n-parafinach lub metanie; te ostatnie stanowią ogromne zasoby energii, które przy wysokiej wydajności zamiany na biomasę bakterii lub drożdży stanowią potencjalne bogate źródła dla pro­dukcji białka paszowego. Tak zwanym niekonwencjonalnym źródłom białka poświęcono w piśmiennictwie polskim szereg prac przeglądowych (Rutkowski 1969, Rakowska, Prończuk 1974, Prończuk 1970, Pijanowski 1969).

Rzepak jest źródłem białka o bardzo korzystnym skła­dzie aminokwasów; wykorzystanie jednak beztłuszczowej mączki rzepakowej jako źródła białka hamuje zawartość glukozydów, o działaniu toksycznym. Podobnie smakowitość i wykorzystanie ziarna plennych odmian łubinu hamuje zawartość alkaloidów.

W tych przypadkach zastosowanie testów biologicznych na wrażliwych drobnych zwierzętach laboratoryjnych może od­grywać rolę badań selekcjonujących linie roślin najbardziej war­tościowych. Uzyskana odpowiedź w tego typu testach biologicz­nych będzie wypadkową działania stymulującego korzystnych substancji odżywczych oraz hamującego — substancji antyodżywczych. Brak jest w tym zakresie wystandaryzowanych metod badania biologicznego.

Kubiczek (1975), w poszukiwaniu metod eliminacyjnych oceny biologicznej wartości białka małych próbek ziarniaków żyta, zaproponował pisklęta przepiórki japońskiej, wykazując duże zróżnicowanie reakcji biologicznej tych ptaków przy żywie­niu różnymi odmianami żyta. Zwrócił przy tym uwagę, że prze­piórki były znacznie bardziej wrażliwe na czynniki antyżywieniowe żyta niż szczury, na których równolegle prowadzono ba­dania porównawcze ziarna tych samych odmian.

Rakowska i wsp. (1976) opracowały test biologiczny przy użyciu tygodniowych piskląt przepiórki japońskiej do badania wartości żywieniowych, jako test całościowej oceny biologicznej ziarna żyta oraz Triticale.

W przypadku badań nad żytem i Triticale ziarno zbóż stanowiło 94% diety, jako jedyne źródło energii i białka i było uzupełniane mieszankami soli mineralnych i witamin. Przepiórki japońskie są łatwo osiągalnymi i dobrze wyrównanymi zwierzę­tami laboratoryjnymi, zwłaszcza do badań eliminacyjnych.

Badanie biologicznej wartości nasion roślin strączkowych należy przeprowadzać po zastosowaniu wstępnego ogrzewania, w celu inaktywacji czynników antyproteolitycznych. Ogrzewa­nie powinno być przeprowadzane zarówno w określonym stan­dardowym czasie, jak i w określonej temperaturze, empirycznie ustalonych na podstawie badania spadku aktywności antytryptycznej.

Według Kozłowskiej (1976) 18-godzinne moczenie ziarna w wodzie destylowanej w stosunku 1 : 2 (ziarno do wody wago­wo), a następnie gotowanie w ciągu od 45 minut do 1 godziny, powoduje unieczynnienie ok. 95% czynnika antytrypsynowego w nasionach grochu, soi i fasoli. Na ogół w produkcji mączki .sojowej stosuje się ogrzewanie „na sucho  mielonego ziarna, w •ciągu 15 minut w temperaturze 105°C lub 10 minut w tempera­turze 121 °C. Rackis (1971) wykazał, że zniszczenie czynników antytryptycznych w mące sojowej jest bardziej skuteczne, przy wilgotności 15-20%. Należy jednak zwrócić uwagę, że w tempe­raturze powyżej 100°C zachodzi reakcja brązowienia (reakcja Maillarda), w której powstają połączenia pomiędzy cukrami pro­stymi zawartymi w nasionach strączkowych a wolną grupą lizyny. Powoduje to spadek przyswajalności tego aminokwasu.

Badanie biologicznej wartości białka nasion różnych od­mian, rodów lub linii roślin strączkowych, po zastosowaniu zaw­sze tego samego ustalonego empirycznie ogrzewania, należy pro­wadzić za pomocą opisanej powyżej metody oznaczania RPV na szczurach.

Zastosowany szczep bakterii nie ma zdolności syntezy da­nego aminokwasu, a dla właściwego wzrostu lub metabolizmu wykorzystuje aminokwasy badanego produktu. Wiele szczepów bakteryjnych polecano do tych celów, między innymi bakterie kwasu mlekowego (Laktobacillus). Jednak późniejsze badania wy­kazały, że wzrost tych mikroorganizmów jest stymulowany przez niektóre peptydy (m. in. streptogeninę) i jest wtedy niepropor­cjonalny do zawartości badanego aminokwasu.

Do badań nad zawartością lizyny, metioniny, cystyny, histydyny, fenyloalaniny, leucyny i izoleucyny poleca się szcze­py Leuconostoc mesenteroides (ATCC 8042), do oznaczeń trypto­fanu, leucyny, izoleucyny i waliny Lactobacillus plantarum (ATCC 8014), a do oznaczeń treoniny Streptococcus faecalis (ATCC 9790). Szczepy te jednak nie mają dostatecznie silnych układów enzymów proteolitycznych, ażeby oznaczenia można było prowadzić na rozpuszczalnych ekstraktach białka. Należy je poddać wstępnie hydrolizie za pomocą silnie działających związków chemicznych, np. hydrolizie za pomocą kwasu solnego (8—12 godzin) lub hydrolizie zasadowej (tryptofan). Początkowo uważano, że wyniki oznaczeń aminokwasów z zastosowaniem metod mikrobiologicznych są równoznaczne z oznaczeniem ami­nokwasów przyswajalnych wykorzystywanych biologicznie. Oka­zało się jednak, że zastosowanie hydrolizy za pomocą 6 N HC1 nawet w ciągu 8—12 godzin może powodować uwolnienie ami­nokwasów z połączeń powstałych w wyniku przetwarzania żyw­ności. Aminokwasy te mogą więc być wykorzystane przez mikro­organizmy. Wykonano próby zastosowania hydrolizy enzyma­tycznej papaina lub pronazą, która pomimo, że nie przebiega ilościowo, umożliwia wykorzystanie aminokwasów przez mikro­organizmy testujące. W tych przypadkach uzyskane wyniki na­leży przyjmować jako oznaczenia aminokwasów przyswajalnych.

W piśmiennictwie polskim prace nad zastosowaniem me­tod mikrobiologicznych do analizy aminokwasów ogólnych opu­blikowały: Kurzepa i wsp. (1958, 1960), oraz aminokwasów przy­swajalnych Szklarska-Cygańska i wsp. (1970) oraz Szkiłłądziowa i wsp. (1974).

Metody mikrobiologiczne w odniesieniu do ogólnej zawar­tości aminokwasów, jako bardzo pracochłonne i żmudne, ustę­pują wobec metod chromatografii kolumnowej lub gazowej. Na­tomiast jest pożądany rozwój metod mikrobiologicznych, po za­stosowaniu hydrolizy enzymatycznej, do oznaczania przyswajal­nych form aminokwasów.

Tryptofan w białkach spożywczych często jest oznaczany w reakcji barwnej z ninhydryną po hydrolizie alkalicznej bada­nego materiału za pomocą wodorotlenku sodowego lub wodoro­tlenku barowego.

Slump i Schreuder (1969) zastosowali hydrolizę za pomocą wodorotlenku barowego, a następnie oddzielenie uwolnionego tryptofanu od jonów baru za pomocą filtracji na żelu Sephadex. Następnie tryptofan oznaczano na automatycznym analizatorze w reakcji barwnej z ninhydryną. Sławiński i Tyczkowska (1974), badając optymalne warunki hydrolizy za pomocą wodorotlenku barowego, stwierdzili że maksimum uwolnienia tryptofanu w hydrolizatach uzyskiwano za pomocą 2,15N Ba(OH)₂ w tempe­raturze 110°C, w czasie 4—16 godzin dla surowców zwierzęcych i 12—16 godzin dla surowców roślinnych. Autorzy ci stwierdzili ponadto, że za pomocą metody kolorymetrycznej z aldehydem p-dwumetyloaminobenzoesowym uzyskali wyniki podobne, jak przy zastosowaniu automatycznego analizatora aminokwasów.

Jak podano w punkcie 5.1.1. są także przeprowadzane próby zapobiegające destrukcji tryptofanu w czasie hydrolizy kwasowej, poprzedzającej analizę za pomocą chromatografii jo­nowymiennej (Matsubara i Sasaki 1969, Penke i wsp. 1974, Liu i Chang 1971). Penke i wsp. (1974) stwierdzają jednak, że zapo­bieganie destrukcji tryptofanu przy dużej zawartości cukrow­ców w próbce nie jest zadowalające.

Opracowano również metody z zastosowaniem hydrolizy enzymatycznej badanego materiału, a następnie oznaczeniem tryptofanu w reakcjach barwnych specyficznych dla pierścienia indolowego, z takimi odczynnikami jak: aldehyd p-dwumetylo-aminobenzoesowy (p-DAB), aldehyd dwumetyloaminocynamono-wy, kwas glioksalowy, kwas p-toluenosulfonowy oraz imid N-bromobursztynowy.

Wśród tych metod na uwagę zasługuje metoda Horna i Jonesa (1945), w modyfikacji Lombarda i de Langa (1965), a w polskim piśmiennictwie metoda opisana przez Skibińską i wsp. (1970). Tryptofan w metodzie tej jest oznaczany po wstępnej hydrolizie enzymatycznej badanego białka za pomocą papainy, w reakcji barwnej z aldehydem p-dwumetyloaminobenzoesowym (p-DAB). Natężenie niebieskiego zabarwienia jest odczytywane na kolorymetrze przy długości fali 600 nm. Powtarzalność wy­ników jest zadowalająca, współczynnik zmienności waha się za­leżnie od materiału badanego od 2,1 do 5,1%. Metoda jest jed­nak dość czasochłonna (hydroliza enzymatyczna trwa 18 godzin). Istnieją różne modyfikacje tej metody. Sławiński i wsp. (1974) jako wstępną zastosowali hydrolizę alkaliczną zamiast hydrolizy enzymatycznej. Spies i Chambers (1950), którzy jako pierwsi za­stosowali reakcję aldehydu p-dwumetyloaminobenzoesowego z wolnym tryptofanem, zaproponowali w 1967 r. wstępne trawie­nie badanego białka za pomocą pronazy.

Spośród metod, które nie wymagają hydrolizy, należy wymienić metodę glioksalową. Opiera się ona na reakcji pierście­nia indolowego z kwasem octowym w obecności chlorku żelaza­wego. Reakcja zaobserwowana przez Adamkiewicza została opi­sana przez Hopkinsa i Cole w 1902 r. (cyt. wg Concona 1975). Opracowano kilka modyfikacji tej metody m.in. Opieńska–Blauth i wsp. (1963), Concon J. M. (1975). Według porównań do­konywanych przez Concona metoda ta daje wiarogodne wyniki.

Niepełna hydroliza enzymatyczna białka za pomocą wy­biórczych enzymów, np. pepsyny, papainy, trypsyny, pozwala jedynie określić różnice w uwalnianiu poszczególnych aminokwa­sów w badanych białkach, zależnie zarówno od budowy danego białka, jak i od ewentualnych zmian, które zaszły w białku pod wpływem obróbki technologicznej.

Ford i Salter (1966) zastosowali metodę trawienia enzy­matycznego do charakteryzowania składu aminokwasowego biał­ka poddanego zróżnicowanej obróbce termicznej. Mauron (1968) zaproponował kilka wskaźników obliczonych na podstawie za­wartości aminokwasów w hydrolizatach enzymatycznych bada­nych białek. Camus i wsp. (1972, 1973), jak również Sautier (1974) stosowali trawienie enzymatyczne, w celu scharakteryzo­wania wartości odżywczej różnych białek.

Przegląd metod enzymatycznych stosowanych w ocenie wartości białek podaje Stakmann i Woldegiorgis (1975).

Na podstawie ilości uwolnionych aminokwasów podczas częściowej hydrolizy enzymatycznej nie można ocenić całkowi­tego poziomu aminokwasów przyswajalnych, ponieważ wiele 2 nich może występować w peptydach niestrawnych in vitro, natomiast rozkładanych in vivo. Stąd są przeprowadzane bada­nia nad dopracowaniem warunków kompletnej hydrolizy enzy­matycznej białka.

Hill i wsp. (1962) oraz Margoliash i wsp. (1962) określili całkowity skład aminokwasów kazeiny i cytochromu c stosując do trawienia następujący układ enzymatyczny: papaina, aminopeptydaza leucynowa, prolidaza.

Pieniążek i wsp. (Pieniążek i wsp. 1975, Kunachowicz i wsp. 1976) zastosowały trawienie enzymatyczne układem pankreatyna, prolidaza, aminopeptydaza leucynowa do oznaczania zawartości aminokwasów przyswajalnych w kazeinie i kazeinie ogrzewanej w doświadczeniach modelowych. Uzyskano zróżnico­wanie uwolnionych aminokwasów największe (63,5% uwolnio­nego azotu aminokwasów) dla kazeiny natywnej, niższe (51,6%) dla kazeiny ogrzewanej i najniższe (36,1%) dla kazeiny ogrze­wanej w obecności cukru. Otrzymano zatem ciekawe wyniki po­równawcze, niemniej jednak ok. 40% azotu aminowego pozosta­wało w kazeinie natywnej nadal w peptydach, a więc hydroliza nie była kompletna.

Wydaje się, że opracowanie warunków kompletnej hy­drolizy enzymatycznej różnych białek mogłoby wnieść istotny postęp w badaniach nad przyswajalnością aminokwasów.

Tłuszcz nie odgrywa większej roli, bo może być łatwo usunięty z próbki drogą ekstrakcji. Stosowana powszechnie hydroliza kwasowa białka za pomocą 6N HC1 w temperaturze 105°C powoduje destrukcję niektórych aminokwasów oraz może prowadzić do absorbowania części aminokwasów na tworzących się z cukrowców substancjach huminowych (Pion 1971). W przy­padku tryptofanu, który w tych warunkach ulega rozłożeniu, jest konieczne przeprowadzenie oddzielnej hydrolizy zasadowej lub enzymatycznej (Friedman i Finley 1975).

Innym zagadnieniem jest oznaczanie aminokwasów siar­kowych, które w czasie hydrolizy mogą ulec częściowemu rozło­żeniu lub utlenieniu. Uwzględniając to, przeprowadza się przed hydrolizą całkowite utlenienie tych aminokwasów, tj. metioniny do sulfonu metioniny, a cystyny do kwasu cysteinowego i w tej formie oznacza się ich zawartość w białku. Utlenione formy ami­nokwasów są stabilne w przebiegu dalszej kwaśnej hydrolizy (Moore 1963, Pion i wsp. 1966). Pozostałe aminokwasy, poza omówionymi, są uwalniane w trakcie hydrolizy kwaśnej z róż­ną szybkością. Na przykład seryna i treonina są uwalniane cał­kowicie stosunkowo szybko (20-24 godziny), podczas przedłużo­nej hydrolizy, następuje częściowe ich rozłożenie. Podobnie za­chowuje się tyrozyna. Natomiast izoleucyna i walina wymagają dłuższego czasu hydrolizy (72 godziny). Wobec różnej szybkości uwalniania poszczególnych aminokwasów prowadzi się albo hy­drolizę w kilku wariantach pod względem czasu i zastosowanie środków ochronnych (Pion 1971), albo też prowadzi się hydro­lizę białka w określonym czasie, np. 20-24 godziny przy jedno­czesnym zastosowaniu obliczonych doświadczalnie współczynni­ków korekcji dla aminokwasów uwalnianych w różnym czasie (Sławiński i wsp. 1973).

Badane produkty poddawane hydrolizie powinny zawie­rać nie więcej niż 5% wody oraz najwyżej śladowe ilości tłusz­czu. Jeśli próbki zawierają większe ilości wody oraz tłuszcz, na­leży je poddać ekstrakcji acetonem w celu odtłuszczenia i od­wodnienia (Brieskom 1963). W tablicy 25 podano stosowany przez autorki schemat warunków hydrolizy za pomocą 6N HC1 prowadzonej w temperaturze 105°C. Stosunek próbki do ilości kwasu solnego powinien być nie niższy niż 1 : 400 (wagowo).

Przeprowadza się cztery równoległe procesy hydrolizy badanej próbki. Dwa razy powtarza się hydrolizę kwaśną 20-godzinną w celu uzyskania podwójnych wyników dla aminokwa­sów aromatycznych i histydyny. Ważne jest, aby hydroliza przebiegała w warunkach beztlenowych, dlatego próbki umiesz­cza się w ampułkach zatopionych pod próżnią. Dodatkowo, w celu zabezpieczenia przed utlenieniem tyrozyny i fenyloalaniny, dodaje się do próbki kilka kropli 5-procentowego roztwo­ru fenolu. Końcowe stężenie fenolu w hydrolizacie jest wielo­krotnie wyższe (ok. 50 razy) w porównaniu do stężenia amino­kwasów aromatycznych, a zatem w przypadku obecności sub­stancji utleniających, jest utleniany głównie fenol, chroniąc w ten sposób tyrozynę i fenyloalaninę.

Równocześnie prowadzi się hydrolizę poprzedzoną utle­nieniem białka w dwóch wariantach czasowych przez 20 : godzin (tabl. 25). Białko utlenia się za pomocą kwasu mrówko­wego (HCOOH+H₂0₂ 30-procentowego w stosunku 9 : 1) doda­wanego w ilości 10 ml do próbki (czas utleniania 20 godzin, temperatura 4°C). Po utlenieniu, metioninę i cystynę oznacza się w postaci jej trwałych pochodnych. Mieszanina aminokwa­sów po przeprowadzonej hydrolizie jest odparowywana do sucha, a następnie rozpuszczana w 0.01N HC1 o pH = 2,0. W tym stanie jest przechowywana i nakładana na kolumnę chromatograficzną w ilości 0,8 ml o stężeniu aminokwasów ok. 0,1 mikromola/ml.

Metody oznaczania tryptofanu omówiono oddzielnie przy końcu tego rozdziału.

Omówione warunki standardowe hydrolizy białek są przyjmowane w licznych laboratoriach. Wiadomo jednak, że hydroliza kwasem solnym budzi szereg zastrzeżeń i są prowadzone liczne próby nad jej udoskonaleniem.

Matsubara i Sasaki (1969) prowadzili hydrolizę białek za pomocą 6N HC1 z dodatkiem 0,6′% kwasu tioglikolowego, w celu wyeliminowania rozkładu tryptofanu zachodzącego w czasie hydrolizy kwaśnej. W tym samym celu Liu i Chang (1971) zastosowali 3N kwas p-tolueno-sulfonowy zawierający 0,2% 3-(2-aminoetyl), indolu.

Penke,- Ferenczi, Kovacs (1974) zaproponowali zastosowa­nie 3N kwasu merkaptoetanosulfonowego w temperaturze 110°C przez 24 i 72 godziny, w celu uzyskania pełnego spektrum aminokwasowego łącznie z tryptofanem. Dotychczasowe próby w tym zakresie były przeprowadzane na czystych białkach, aczkolwiek rozważano również wpływ dodatku cukrowców.

Aktualnie są prowadzone próby wskazujące na duże na­dzieje zastosowania 3N kwasu merkaptoetanosulfonowego do hy­drolizy białka różnego typu produktów żywnościowych (Bod-well C. E. 1975)D.

Podobnie, zastosowanie chromatografii bibułowej pozwa­lało śledzić pełne spektrum aminokwasów (cyt. wg Leggett Bai-ley 1967). Muszkatowa (1963) stosowała chromatografię bibuło­wą do badań nad zawartością aminokwasów w produktach spo­żywczych. Często jednak aminokwasy, najważniejsze z punktu widzenia  żywieniowego,   były  najtrudniejsze   do  rozdzielenia

rażenia ilościowego. Rozdział aminokwasów na bibule ode­brał jednak dużą rolę w zakresie ich analizy jakościowej i w tym też zakresie ma do dziś duże znaczenie.

Największe znaczenie w analizie ilościowej składu aminokwasowego znalazła jednak metoda jonowymiennej chromatogra­fu kolumnowej, opracowana w latach pięćdziesiątych przez Ioore’a, Steina i Spackmana (Moore i wsp. 1951, 1954 a, b, 1958, 1963). Zasadą metody jest chromatograficzne rozdzielenie amino-kwasów przy użyciu żywicy jonowymiennej po uprzedniej hy­drolizie białka, a następnie kolorymetryczne oznaczenie barw­nych związków, powstałych w wyniku reakcji aminokwasów z ninhydryną.

Oznaczenie składu aminokwasowego białka przebiega za-:em dwuetapowo. W pierwszym etapie przeprowadza się hydro­lizę białka do aminokwasów. W drugim etapie dokonuje się roz­działu mieszaniny aminokwasów na kolumnie wypełnionej kationitem. Druga część analizy jest prowadzona na ogół przy za­stosowaniu automatycznego analizatora aminokwasów. Współcześnie metoda Moore’a i wsp. należy do najbardziej popular­nych i podlega ciągłym usprawnieniom. Użycie nowych rodza­jów żywic, bardziej odpowiednich buforów, a także zastosowa­nie zwiększonego ciśnienia przepływu buforów pozwala na skracanie czasu analizy i zwiększanie jej dokładności. Stąd wy­nika stały postęp w opracowywaniu i produkcji nowych zauto­matyzowanych analizatorów aminokwasów (Niederwieser i Pa-taki 1971).

Rozważając metody ilościowej analizy aminokwasów po­dano poniżej te, które uznano dotąd za najprostsze, a jednocześ­nie najbardziej dokładne i powtarzalne, dlatego najbardziej po­lecane. Alternatywne są metody chromatografii gazowo-cieczowej (GLC), nad którymi aktualnie są prowadzone prace w celu ustalenia technik badawczych (Kubacka i wsp. 1975, Niederwie­ser i wsp. 1971, Okuniewska i wsp. 1971).

Według Rakowskiej i wsp. (1970) oraz Waterlow i wsp. (1967, 1968) tempo syntezy białka przypadające na jednostkę ma­sy ciała u człowieka jest sześciokrotnie niższe w porównaniu do tempa syntezy w tkankach szczura. Jeżeli jednak tempo syntezy białka u porównywanych organizmów przeliczyć na tzw. meta­boliczną masę ciała (kg masy ciała podniesiony do potęgi 0,75) stosunek tempa syntezy białka u człowieka do tempa syntezy u szczura będzie tylko 1,7 raza niższy.

Z powyższych stwierdzeń można wyciągnąć wniosek, że maksymalna wydajność wykorzystania aminokwasów do syntezy białka własnych tkanek, co jest właściwie miarą biologicznej wartości podanego białka, u porównywanych organizmów będzie podobna przy ograniczeniu spożycia białka, tj. w tych warun­kach, gdy zawartość któregoś z aminokwasów egzogennych bę­dzie ograniczała możliwości syntezy białka.

Z licznych prac wiadomo (Miller, Bender 1955, Miller i Payne 1964, Rafalski 1967, Bressani 1973), że wydajność wy­korzystania białka dla syntezy białka w ustroju; zarówno szczu­rów, jak i dzieci, spada wraz z wysokością jego spożycia. Wa­runkiem zatem uzyskania porównywalnych wyników biologicz­nej oceny białka z badań na odległych sobie gatunkach jest ba­danie wydajności wykorzystania białka przy ograniczonym spo­życiu, poniżej optimum dla wzrostu szczurów lub w zakresie lek­ko ujemnego do lekko dodatniego bilansu azotowego zarówno u szczurów, jak i u ludzi.

Inną kategorię rozważań stanowią badania tzw. wartości żywieniowej wg nomenklatury użytej przez Bressaniego (1973) lub itiżw. procentu operatywnego wykorzystania białka (NPU_op) zaproponowanego przez Platta, Millera i Payna (1961) do oceny na szczurach wartości diet odpowiadających swym składem spo­życia grup ludności. W tych przypadkach procent wykorzystania białka przy niewystandardowanych jego poziomach oraz przy różnej zawartości innych składników diety, nie jest miarą war­tości biologicznej białka tych diet sensu stricto. W tych warun­kach przenoszenie wyników z badań na szczurach może mieć wartość wątpliwą.