Określenie wartości odżywczej białka na podstawie zawartości aminokwasów

Mikrobiologiczne metody oznaczania aminokwasów

Mikrobiologiczne metody oznaczania aminokwasów oparto o za­łożenie, że wzrost mikroorganizmów jest wprost proporcjonalny do zawartości danego aminokwasu. Zastosowany szczep bakterii nie ma zdolności syntezy da­nego aminokwasu, a dla właściwego wzrostu lub metabolizmu wykorzystuje aminokwasy badanego produktu. Wiele szczepów bakteryjnych polecano do tych celów, między innymi bakterie kwasu mlekowego (Laktobacillus). Jednak późniejsze badania wy­kazały, że wzrost tych mikroorganizmów jest stymulowany przez niektóre peptydy (m. in. streptogeninę) i jest wtedy niepropor­cjonalny do zawartości badanego aminokwasu. Do badań nad zawartością lizyny, metioniny, cystyny, histydyny, fenyloalaniny, leucyny i izoleucyny poleca się szcze­py Leuconostoc mesenteroides (ATCC 8042), do oznaczeń trypto­fanu, leucyny, izoleucyny i waliny Lactobacillus plantarum (ATCC 8014), a do oznaczeń treoniny Streptococcus faecalis (ATCC 9790). Szczepy te jednak nie mają dostatecznie silnych układów enzymów proteolitycznych, ażeby oznaczenia można było prowadzić na rozpuszczalnych ekstraktach białka. Należy je poddać wstępnie hydrolizie za pomocą silnie działających związków chemicznych, np. hydrolizie za pomocą kwasu solnego (8—12 godzin) lub hydrolizie zasadowej (tryptofan). Początkowo uważano, że wyniki oznaczeń aminokwasów z zastosowaniem metod mikrobiologicznych są równoznaczne z oznaczeniem ami­nokwasów przyswajalnych wykorzystywanych czytaj dalej

Oznaczanie tryptofanu

Oddzielne zagadnienie w analizie aminokwasów stanowi ozna­czanie tryptofanu, który podczas hydrolizy kwasowej 6N HC1 ulega prawie całkowitemu rozkładowi. Istnieje szereg metod do oznaczania tego ważnego aminokwasu. Tryptofan w białkach spożywczych często jest oznaczany w reakcji barwnej z ninhydryną po hydrolizie alkalicznej bada­nego materiału za pomocą wodorotlenku sodowego lub wodoro­tlenku barowego. Slump i Schreuder (1969) zastosowali hydrolizę za pomocą wodorotlenku barowego, a następnie oddzielenie uwolnionego tryptofanu od jonów baru za pomocą filtracji na żelu Sephadex. Następnie tryptofan oznaczano na automatycznym analizatorze w reakcji barwnej z ninhydryną. Sławiński i Tyczkowska (1974), badając optymalne warunki hydrolizy za pomocą wodorotlenku barowego, stwierdzili że maksimum uwolnienia tryptofanu w hydrolizatach uzyskiwano za pomocą 2,15N Ba(OH)2 w tempe­raturze 110°C, w czasie 4—16 godzin dla surowców zwierzęcych i 12—16 godzin dla surowców roślinnych. Autorzy ci stwierdzili ponadto, że za pomocą metody kolorymetrycznej z aldehydem p-dwumetyloaminobenzoesowym uzyskali wyniki podobne, jak przy zastosowaniu automatycznego analizatora aminokwasów. Jak podano w punkcie 5.1.1. są także przeprowadzane próby zapobiegające destrukcji tryptofanu w czasie hydrolizy kwasowej, poprzedzającej analizę za pomocą chromatografii jo­nowymiennej (Matsubara i Sasaki 1969, Penke i wsp. 1974, Liu i Chang 1971). Penke i wsp. czytaj dalej

Hydroliza enzymatyczna

Hydroliza kwasowa białek jest zabiegiem drastycznym. Dlatego są także czynione próby zastosowania hydrolizy enzymatycznej. Uwolnienie aminokwasów podczas hydrolizy kwasowej jest z pewnością odmienne od uwalniania aminokwasów podczas hy­drolizy enzymatycznej, zachodzącej w trakcie trawienia białka w przewodzie pokarmowym. W warunkach trawienia enzyma­tycznego kompletnie uwalniane aminokwasy można określić jako aminokwasy przyswajalne w odróżnieniu od uwalnianych po hy­drolizie kwasowej aminokwasów ogólnych. Do badań nad przyswajalnością aminokwasów stosuje się zarówno pojedyncze en­zymy, jak i układy enzymatyczne. Niepełna hydroliza enzymatyczna białka za pomocą wy­biórczych enzymów, np. pepsyny, papainy, trypsyny, pozwala jedynie określić różnice w uwalnianiu poszczególnych aminokwa­sów w badanych białkach, zależnie zarówno od budowy danego białka, jak i od ewentualnych zmian, które zaszły w białku pod wpływem obróbki technologicznej. Ford i Salter (1966) zastosowali metodę trawienia enzy­matycznego do charakteryzowania składu aminokwasowego biał­ka poddanego zróżnicowanej obróbce termicznej. Mauron (1968) zaproponował kilka wskaźników obliczonych na podstawie za­wartości aminokwasów w hydrolizatach enzymatycznych bada­nych białek. Camus i wsp. (1972, 1973), jak również Sautier (1974) stosowali trawienie enzymatyczne, w celu scharakteryzo­wania wartości odżywczej różnych białek. Przegląd metod czytaj dalej

Hydroliza kwasowa badanego materiału

W przypadku badania produktów spożywczych lub pasz rzadko mamy do czynienia z białkami czystymi. Hydrolizę białka prze­prowadza się zatem w środowisku złożonym, w którym obecne są czynniki, a zwłaszcza cukrowce, mogą wpływać niekorzystnie na przebieg procesu hydrolizy. Tłuszcz nie odgrywa większej roli, bo może być łatwo usunięty z próbki drogą ekstrakcji. Stosowana powszechnie hydroliza kwasowa białka za pomocą 6N HC1 w temperaturze 105°C powoduje destrukcję niektórych aminokwasów oraz może prowadzić do absorbowania części aminokwasów na tworzących się z cukrowców substancjach huminowych (Pion 1971). W przy­padku tryptofanu, który w tych warunkach ulega rozłożeniu, jest konieczne przeprowadzenie oddzielnej hydrolizy zasadowej lub enzymatycznej (Friedman i Finley 1975). Innym zagadnieniem jest oznaczanie aminokwasów siar­kowych, które w czasie hydrolizy mogą ulec częściowemu rozło­żeniu lub utlenieniu. Uwzględniając to, przeprowadza się przed hydrolizą całkowite utlenienie tych aminokwasów, tj. metioniny do sulfonu metioniny, a cystyny do kwasu cysteinowego i w tej formie oznacza się ich zawartość w białku. Utlenione formy ami­nokwasów są stabilne w przebiegu dalszej kwaśnej hydrolizy (Moore 1963, Pion i wsp. 1966). Pozostałe aminokwasy, poza omówionymi, są uwalniane w trakcie hydrolizy kwaśnej z róż­ną szybkością. Na przykład seryna i treonina są uwalniane cał­kowicie stosunkowo szybko (20-24 czytaj dalej

Analiza zawartości aminokwasów w białkach produktów żywnościowych

Ujmując historycznie rozwój metod analizy aminokwasów w za­stosowaniu do oceny wartości produktów spożywczych, należy w pierwszym rzędzie podkreślić wprowadzenie metod mikrobio­logicznych do ilościowego oznaczania aminokwasów w latach czterdziestych przez Wooda, Snella i Barton-Wrighta (cyt. wg Kavanagh 1963). Podobnie, zastosowanie chromatografii bibułowej pozwa­lało śledzić pełne spektrum aminokwasów (cyt. wg Leggett Bai-ley 1967). Muszkatowa (1963) stosowała chromatografię bibuło­wą do badań nad zawartością aminokwasów w produktach spo­żywczych. Często jednak aminokwasy, najważniejsze z punktu widzenia  żywieniowego,   były  najtrudniejsze   do  rozdzielenia rażenia ilościowego. Rozdział aminokwasów na bibule ode­brał jednak dużą rolę w zakresie ich analizy jakościowej i w tym też zakresie ma do dziś duże znaczenie. Największe znaczenie w analizie ilościowej składu aminokwasowego znalazła jednak metoda jonowymiennej chromatogra­fu kolumnowej, opracowana w latach pięćdziesiątych przez Ioore’a, Steina i Spackmana (Moore i wsp. 1951, 1954 a, b, 1958, 1963). Zasadą metody jest chromatograficzne rozdzielenie amino-kwasów przy użyciu żywicy jonowymiennej po uprzedniej hy­drolizie białka, a następnie kolorymetryczne oznaczenie barw­nych związków, powstałych w wyniku reakcji aminokwasów z ninhydryną. Oznaczenie składu aminokwasowego białka przebiega za-:em dwuetapowo. W pierwszym etapie czytaj dalej